丁香假单胞菌是十大植物病原菌之一，寄主范围广泛，已严重威胁全球农业生产。目前，丁香假单胞菌病害防治依赖于铜制剂（如硫酸铜）和抗生素（如链霉素），易产生植物药害、病原抗药性和细菌群落结构变化等问题。近日，中国学者在国际学术期刊《EnvironmentalScienceandEcotechnology》撰文，发现利用复合微生物菌剂可以通过调控叶际微生物群落结构，防治丁香假单胞菌引起的烟草野火病，为该类病害的防治提供了新的途径。
【背景】人们对铜制剂和抗生素应用带来的生态和环境风险的认识不断提高，增加了对更安全的替代品的需求。生物防治环境友好，防治效果显著且稳健，最重要的是，对非目标物种的负面影响远小于对目标物种的影响。研究表明叶片共附生微生物群的变化，特别是有益细菌的富集，可能在抑制病原丁香假单胞菌和诱导植物系统抗性方面发挥关键作用。
【科学问题】尽管植物和病原丁香假单胞菌单个菌株与生物防治剂之间的二元相互作用已被广泛报道，但对多物种生物防治剂如何影响病原菌与叶际微生物群的相互作用以及受干扰的微生物群落如何影响植物代谢知之甚少。
【目标】探讨生防菌剂和抗生素卡苏霉素对（1）叶际微生物群落的结构和组装，（2）丁香和有益细菌之间的相互作用，以及（3）植物致病相关基因的表达强度的影响。
【研究方法】1.实验设计和样品采集
田间小区试验种植野火病感病品种“云烟87”。在田间初现病斑后，进行3个处理：（i）CK，10L不含药剂的水；（ii）Km，10g卡苏霉素（4%w/w，稀释1000倍，HanweiBio-TechnologyScienceCo.，有限公司），和（iii）BA，1g生物防治剂BCA_B（稀释10000倍），均匀地喷洒在烟叶的两侧。生防菌剂主要成分为芽孢杆菌（87.74%）、产碱杆菌（7.69%）、假慢性杆菌（2.86%）和无色杆菌（1.05%）。每个处理包含90株植物（三列，相距1.2米；30行，相距0.5米），三次重复。随机区组排列。在每个小区随机标记5株植物，并在7天后调查野火病的感染率和疾病指数。（批注：生产上一般用药2-3次，该试验只喷施了1次就调查，是否合理？）
每个小区中从五株标记植物中随机挑选三片烟叶，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液洗涤每个叶子表面来收集微生物样品。然后用液氮冷冻叶片，并用干冰包将其运至实验室。微生物和烟叶样品在−80°C下储存，直到提取DNA和RNA。
2.DNA提取、文库构建和测序
使用®StoolDNAKit(D4015,Omega,Inc.,USA)试剂盒提取叶际微生物DNA。基因组文库用TruSeqNanoDNA文库制备试剂盒（#FC-121-4001，Illumina，USA）制备，在IlluminaNovaseq6000上进行测序。
3.RNA分离、文库构建和测序
使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分离植物RNA。使用NanoDropND-1000（NanoDrop，Wilmington，DE，USA）对RNA的浓度和纯度进行定量。使用DynabeadsOligo（dT）25-61005（ThermoFisher，CA，USA）通过两轮纯化特异性捕获聚（A）RNA。使用镁RNA片段化模块（NEB，，USA）在94°C下将聚（A）RNA片段化为小块，持续5–7分钟。通过SuperScripII逆转录酶（Invitrogen，，USA）逆转录切割的RNA片段以创建最终大小为300±50bp的cDNA文库。在IlluminaNovaseq6000（LC-BioTechnologyCo.，有限公司，杭州，中国）上进行PE150测序。
4.测序读取组装、分类和功能分配
对宏基因组原始测序读数进行质控，以排除衔接子序列、低质量序列（fastq[22]）和受污染的DNA，包括宿主（bowtie2）。将所有样本的干净读数汇集在一起，并通过Megahit（）进行组装，通过Prodigal（）使用参数“-pmeta”进行基因预测。使用cdhitest（）预测的基因模型构建了非冗余基因目录。基于bowtie2（）的比对读数数量，通过TPM估计特定样本的单基因丰度。
使用fastq清洁转录组原始测序读数，以排除衔接子和低质量序列。然后，通过Trinity（）汇编干净的读数，并使用cdhitest对转录物进行聚类。通过三文鱼计算的TPM测量转录物表达水平（）。
mOTU（）进行了分类分配。unigenes的功能注释是基于针对eggNOG（v5）的DIAMOND比对。属、种、京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径和KEGG正交学（KO）相对丰度是通过对每个样本属于每个类别的相应基因的丰度求和来计算的。
5.统计分析
Choa1、Shannon和Simpson指数用于多样性分析。基于Bray-Curtis相异性值的主坐标分析（PCoA）用于评估微生物群落和植物表达结构的总体差异。通过方差分析（ANOVA）检验确定各组之间的显著分类和功能差异，并通过多次检验的错误发现率（FDR）方法进行调整。根据属与属之间的Spearman秩相关系数构建共现网络，并用对网络进行可视化。通过基于系统发育箱的零模型分析（iCAMP）推断群落组装机制用于量化微生物群落组装。
【主要结论】1.卡苏霉素和生防菌剂防病效果显著
卡那霉素Km和生防菌剂BA处理的发病率和病情指数与对照组CK相比有所下降。但BA防病效果更好。
2.生防菌剂改变了微生物多样性和群落结构
Km组和BA组的微生物丰富度（Chao1指数）均显著低于CK组。ADONIS结果表明，微生物群落的结构存在显著差异。在属水平上，叶际微生物群落的组成存在显著差异。BA组中鞘氨醇单胞菌和甲基杆菌的相对丰度显著高于其他两组，而假单胞菌则相反。（批注：优势菌群里竟然没有生防菌剂相关物种，是这些物种没有定殖，还是短暂的定殖改变了群落结构？施用菌剂没有存活下来，却改变了群落结构，这可能是更有意义的科学问题）
不同处理叶际微生物组比较
3.生防菌剂处理叶际微生物物种共现性网络更复杂
假单胞菌、鞘氨醇单胞菌和甲基杆菌在三个子网络中占优势。假单胞菌在BA（5.8%）和Km（11.7%）子网络节点中的相对比例低于CK组（19.8%）（图1c）。相反，与CK（13.4%和8.0%）相比，鞘氨醇单胞菌和甲基杆菌在Km（33.0%和34.9%）和BA（21.3%和17.4%）子网络中的相对比例增加。BA子网络中所有配对节点之间的平均路径长度明显短于CK子网络，这表明BA网络具有更高的效率。Km子网络的平均程度明显低于CK子网络，表明网络成员之间的复杂关系。通卡苏霉素降低了叶层微生物的生物多样性和病原菌的丰度，而生防剂则专门富集了拮抗菌，增加了有益菌之间的合作，抑制了病原菌的生长。
4.生防菌剂会削弱群落组装中环境或生物选择的限制
为了探索生物控制剂在微生物群落组装中的作用，将394个OTU分为9个系统发育箱，计算了生态过程的相对重要性（RI）。系统发育箱4的组装主要由同质选择驱动（RI=69.4%），其余八个系统发育箱的组装则由漂移主导（RI=73.7-97.0%）。表明系统发育箱4的成员比其他系统发育箱的成员更容易受到环境或生物选择的影响。系统发育bin4包含假单胞菌的主要成员，占相对比例的40.7%，它们在BA和Km组中的相对丰度低于CK组。生防菌剂可能主要针对系统发育bin4中的病原物种进行控制。由鞘氨醇单胞菌成员组成的系统发育bin2和bin5在BA和Km组中的相对丰度显著高于CK组（）。BA组和Km组在群落组装中的同质选择的相对重要性低于CK组。表明，使用生物防治剂或卡苏霉素可能会抑制这些敏感物种，从而削弱群落组装中环境或生物选择的限制。
叶际微生物组装机制
5.鞘氨醇单胞菌可能抑制病原菌的趋化性和毒力。
为了探索“叶际微生物多样性和相互作用”中确定的关键属，包括假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属和甲基杆菌属，如何调节叶层微生物群落的功能结构，基于上述三个属的相对丰度和KEGG同源性构建了一个相关网络（，r≥0.7）。三个属主要与18个同源物相连，这些同源物隶属于碳水化合物代谢酶、三磷酸腺苷依赖性Clp蛋白酶、谷胱甘肽S-转移酶和趋化蛋白。表明鞘氨醇单胞菌可能通过竞争碳源来抑制丁香假单胞菌在叶层的生长。
谷胱甘肽S-转移酶（K00799）和ATP依赖性Clp蛋白酶的两个ATP结合亚基（K03695和K03544）与鞘氨醇单胞菌呈正相关，在BA组中也具有最高的相对丰度。ATP依赖性Clp蛋白酶在运动性、生物膜形成和应激适应中发挥着不可或缺的作用[42]，谷胱甘肽S-转移酶被认为是参与许多病理和生理过程的解毒酶，这两种酶都可以进一步提高鞘氨醇单胞菌在抑制病原体丁香假单胞菌过程中的适应性和竞争力。同时，与假单胞菌呈正相关的趋化蛋白MotA（K02556）、CheR（K00575）和CheW（K03408）在BA组中显示出最低的相对丰度。这些趋化性蛋白有助于丁香假单胞菌的毒力和致病适应性。这意味着生防菌剂可能会干扰丁香假单胞菌的趋化系统以进行病害控制。
生防菌剂对叶际微生物功能基因的影响
6.鞘氨醇单胞菌和甲基杆菌激活植物防御信号途径
BA组（1102）中参与激素信号转导的植物基因的表达强度比CK组（403）显著增加了1.7倍，包括脱落酸（ABA）、乙烯（ET）、茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）。与CK组相比，BA组（13.4）中编码乙烯不敏感蛋白3（EIN3，K14514）的基因在ET反应途径中的表达上调了1.7倍，而BA组（39.9）中SA的调节蛋白NPR1（NPR1，K14508）的表达下调了15.4%。至于植物宿主的JA信号通路，病原体丁香假单胞菌利用它来提高其毒力[48]，BA组（549.1）编码茉莉酸ZIM结构域蛋白（JAZ，K13464）的基因表达比CK组上调9.8倍。
构建了一个基于植物功能基因表达强度的加权基因共表达网络。共检测到12个网络模块，与假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属和甲基杆菌属三个关键属有关。值得注意的是，一个模块，MEyellow，与上述三个关键属显著相关，其由352个基因组成，在3级参与130个KEGG途径。其中，来自前十大KEGG途径的基因的相对比例，包括光合作用、植物激素信号转导、伴侣和折叠催化剂、内质网中的蛋白质加工、线粒体生物发生、转运蛋白、植物-病原体相互作用、谷胱甘肽代谢、外泌体和核糖体，占MEyellow模块中节点的54.6%以上。结果表明，生防剂通过抑制JA信号传导和激活ABA、ET和SA介导的气孔防御和发病机制相关基因表达，增强了植物对丁香的抗性。
生防菌剂影响植物基因表达
【点评】
传统上人们想当然的认为生防菌剂通常依靠定殖，通过营养、生态位竞争以及直接抑菌作用发挥防病作用。该研究通过解析大田条件下生防菌剂对田间环境中叶际微生物群落和植物的影响，发现生防菌剂并非靠自身定殖（至少不是优势种群）而是通过增加有益细菌的丰度和取代病原菌的生态位来预防叶部病害，并揭示了有益细菌和植物对病原体协同作用的机制，包括抑制病原菌趋化系统，激活植物防御基因表达等。该研究对理解生防菌剂防治叶斑类病害机制提供了新的见解。
生防菌剂防治叶斑病作用机制示意图
